U HRVATSKOJ za sada ne postoji sustavno organiziran postupak sekvenciranja virusa, osobito ne cijelog genoma kojim bi se moglo kvalitetno pratiti cirkuliranje poznatih varijanti SARS-CoV-2 te dolazak i nastajanje novih, upozorio je za Index molekularni biolog Kristian Vlahoviček s Biološkog odsjeka PMF-a.

Zbog toga bi nam se, kaže, moglo dogoditi da nam prvo negdje bukne žarište novog soja koji se brže širi, a da tek onda shvatimo što se događa.

Širenje britanskog soja može uzrokovati niz ozbiljnih problema

Budući da je britanski soj virusa, koji se potvrđeno brže širi, već prisutan u sedamdesetak zemalja širom svijeta, uključujući i neke susjedne, poput Slovenije, Srbije i Italije, samo je pitanje vremena kada će se otkriti i kod nas. Neki su naši stručnjaci posljednjih dana upozoravali da postoji mogućnost da je već prisutan. No, s obzirom da nam brojevi novozaraženih još uvijek padaju, za pretpostaviti je da se još nije ozbilljnije proširio.

Ali kako nemamo organizirano sustavno sekvenciranje virusa ni PCR testove na nove sojeve, nije za očekivati da ćemo ga pronaći na vrijeme. Njegovo pravovremeno otkrivanje važno je iz cijelog niza razloga. Prije svega, zato da se njegovo širenje može staviti pod kontrolu kako bi se suzbio prije nego što pokrene velika nova žarišta. Ako se raširi u populaciji, bit će ga teže suzbiti, što znači da će nam trebati strože nefarmaceutske epidemiološke mjere kako bismo ga zaustavili. Također bi se moglo dogoditi da će nam trebati značajno više cjepiva za stvaranje kolektivnog imuniteta koji bi nas zaštitio od zaraznijih sojeva. Konačno, daljnje mutiranje novih sojeva moglo bi oslabjeti djelovanje postojećih cjepiva.

Koliko je problem ozbiljan pokazuje situacija u Izraelu koji posljednjih tjedana ima strašan treći val epidemije unatoč strogim mjerama i vrlo uspješnoj masovnoj kampanji cijepljenja u kojoj su do sada od ukupno 9.3 milijuna ljudi procijepljena gotovo tri milijuna. Ondje se britanski soj toliko raširio da sada čini oko pola svih novih slučajeva. Uz to otkrivena je i prisutnost nekoliko desetaka slučajeva infekcije južnoafričkim sojem te nekoliko slučajeva s varijacijom s mutacijama koje su potekle iz Kalifornije. Izraelski stručnjaci zbog trećeg vala, u kojem se bilježe i teže kliničke slike, razmišljaju o proširenju kampanje cijepljenja na rizične mlađe od 16 godina. Neke bolnice u toj zemlji trenutno imaju velikih problema sa zbrinjavanjem svih teško oboljelih.

Nove varijante možemo prepoznavati PCR testovima ili sekvenciranjem

Vlahoviček kaže da bi se dolazak novog britanskog soja mogao prepoznati na dva načina.

"Jedan je da se nabave brzi PCR testovi koji prepoznaju baš taj soj. Primjerice, Slovenci su nabavili takve PCR testove", kaže Vlahoviček.

Drugi pristup je da se povremeno, na tjednoj bazi, uzimaju reprezentativni uzorci iz različitih dijelova Hrvatske te da se sekvencira cijeli virusni genom.

"Ova druga metoda, koja je zlatni standard, omogućila bi bolje praćenje razvoja situacije. Za to bi bilo optimalno prikupiti 100-tinjak reprezentativnih uzoraka svakih 10 dana. To je ono što naš multidisciplinarni tim na Ruđeru, PMF-u i u Centru Ivan Vučetić, okupljen oko projekta sekvenciranja koronavirusa i domaćina, može odraditi. Reprezentativni uzorci mogli bi se uzimati ciljano u onim lokacijama na kojima očekujemo da postoji veća mogućnost dolaska novog soja. Ako bi se otkrio jedan uzorak koji pokazuje prisutnost novog soja na sto obrađenih, to bi značilo da je novi soj već prisutan u otprilike jedan posto populacije", dodao je.

Vlahoviček smatra da bi vjerojatno bilo najbolje raditi kombinirajući oba pristupa.

"To ne bi trebalo biti preskupo za državu. Za PCR dijagnostiku troše se već sada milijuni kuna. Mi u okviru svoje ekipe već imamo uhodane eksperimentalne i računalne procedure prilagođene upravo takvim problemima. Najvažnije je da se s time ne čeka, da ne kasnimo, kako nam se ne bi dogodilo da ga otkrijemo tek kada se novi, zarazniji soj već proširi. Treba se na vrijeme organizirati i treba djelovati", poručio je Vlahoviček.

Što sve podrazumijeva sekvenciranje i koliko košta?

Za Index je objasnio kako se sekvencira genom virusa, što to sve podrazumijeva i koliko to košta.

"Mi smo sekvencirali 60-ak uzoraka koji pokrivaju cijeli genom virusa, svih 30-ak tisuća baza, odnosno nukleotida A, T, G i C. To se radi tako da se iz uzoraka brisa nosne sluznice izolira RNA slično kao što se to radi za PCR testove. Kada se uzorci dobiju, RNA virusa se postupkom tzv. reverzne transkripcije prepisuje u DNA kako bi bila spremna za sekvenciranje. Zatim se iz takvog uzorka, koji sadrži mješavinu genetičkog zapisa virusa i čovjeka iz kojeg je uzorak izuzet, treba ciljano umnožiti virusna DNA. To se radi tako da se u materijal dodaju tzv. prajmeri ili početnice. Oni se vezuju za sekvence genoma i služe kao klice za polimerazu koja će od nukleotida koji su joj na raspolaganju umnožavati dijelove. Ishodišni materijal mora biti dobre kvalitete i sadržavati što dulje dijelove virusnog genoma. Takvim ciljanim umnažanjem dobivamo segmente virusnog genoma od po 400 parova baza koji se djelomično međusobno preklapaju. Oni se konačno pripremaju za sekvenciranje u postupku koji se zove priprema knjižnice (library preparation), sekvenciraju i slažu u cjeloviti genom – poput domino pločica. Sto takvih dijelova od po 400 parova u konačnici pokrije cijeli genom. Za sekvenciranje cijelog genoma virusa potreban je kvalitetan početni materijal, odnosno uzorak brisa, koji ne smije dugo stajati nakon izuzimanja", kaže naš molekularni biolog.

U okruženju u kojem se trenutno nalazimo, zbog tržišnih okolnosti u pandemiji, cijena samih kemikalija koje su potrebne za istovremeno sekvenciranje 60 do 100 uzoraka iznosi oko 100.000 kuna.

"Dakle, to je oko 1000 kuna po uzorku. Te uzorke očitava stroj, međutim, svaki od njih treba laboratorijski pripremiti. Svaki uzorak se označava, odnosno barkodira, a potom se svi zajedno sekvenciraju. U to nije uključena cijena rada u laboratoriju ni cijena rada na prikupljanju uzoraka ili analize rezultata", kaže Vlahoviček.

Smatra da se kvalitetno praćenje pojave i razvoja novih varijanti može bez problema organizirati, da je dovoljno imati dobre volje jer već postoje uređaji i ljudi koji to mogu raditi.

"Mi smo taj postupak sekvenciranja uhodavali nekoliko mjeseci i s prvim rezultatima u kojima smo obradili 60-ak uzoraka izašli smo krajem 2020. Sad tom postupku možemo dosta rutinski pristupati. Tu imamo prednost u odnosu na mnoge druge kojima bi za to uhodavanje trebalo neko vrijeme. Također, treba imati računalne biologe koji će sekvencirane podatke analizirati. Naime, neće iz stroja izaći gotovi rezultati. Mi imamo pet takvih biologa u timu. Sekvencirani genom treba usporediti s referentnim kako bi se otkrila mjesta na kojima je virus mutirao. Konačno se to uspoređuje s već sekvenciranim varijantama virusa u svijetu. Prepoznaje se kamo bi taj naš virus spadao i utvrđuje se ima li možda još neke dodatne mutacije", objasnio je Vlahoviček.

HZJZ i Stožer šute

Hrvatskom zavodu za javno zdravstvo, Krunoslavu Capaku i Stožeru u sreijdu smo poslali upite mailom i SMS-om u kojima smo zamolili da nam objasne što se poduzima u tom kontekstu, no do objavljivanja ovog teksta nismo dobili nikakve odgovore.